Несмотря на значительный прогресс в подходах к поиску терапевтических соединений, существует длинный перечень заболеваний, не поддающихся лечению обычными низкомолекулярными лекарственными средствами. При некоторых патологиях синтеза сложных белков со специфическими биологическими функциями необходимо осуществлять непосредственно в клетках пациента. Некоторые сложные белковые молекулы или даже клеточные терапевтические средства гораздо более эффективны, когда производятся непосредственно в организме человека. Кроме того, эпидемии в высокомобильном глобализированном мире требуют экономически эффективного и масштабного производства сложных вакцин, которые можно оперативно адаптировать к быстроизменяющимся антигенам возбудителя.
ЮРіЯ-ФАРМ разрабатывает генотерапию следующего поколения, основанную на способных к самоамплификации мРНК. Эти решения обеспечивают экспрессию иммуногенных и неиммуногенных РНК и белков в клетках организма человека. Разработанная нами технологическая платформа имеет ряд преимуществ перед современными решениями:
- экспрессия иммуногенных и неиммуногенных белков in situ;
- экспрессия продолжительностью в месяц после введения одной дозы;
- возможность титрования терапии для достижения необходимого фармакологического эффекта;
- различные возможности для дозировки.
У нашей платформы есть все технические возможности, необходимые для доклинического производства и разработки терапевтических средств на основе мРНК.
мРНК-экспрессирующие векторы
Терапевтические количества белка, длительность и клеточная специфичность экспрессии, фармакокинетический профиль – все кодируется и контролируется нуклеотидной последовательностью транслируемых и нетранслируемых участков мРНК.
Наша оптимизированная векторная библиотека содержит несколько экспериментально подтвержденных модулей, включая:
- оптимизированные последовательности, фланкирующие промотор для T7 РНК-полимеразы;
- 5’UTR последовательности для оптимизированной Cap-зависимой и cap-независимой трансляции (с помощью IRES);
- 3’UTR последовательности для контроля субклеточной локализации, клеточно-специфической экспрессии, функционального полураспада и т.д.;
- библиотеку последовательностей для котранскрипционного полиаденилирования
- вспомогательные элементы (аптамеры, рибозимы).
Собственная платформа создания векторов PUZZLEX позволяет бесшовно собирать библиотеку и заменять любой модуль, необходимый для оптимальной функциональности РНК.
Мы работаем над технологией нового поколения мРНК векторов, способных генерировать кольцевую РНК.
Все векторы оптимизированы для создания большого количества копий, стабильного размножения в E. coli и пригодны для сборки длинных (до 12 кб) конструкций.
Оптимизированный процесс производства и очистки мРНК
Процесс получения мРНК проще любого типичного варианта производства рекомбинантных белков. Однако обеспечение экономически эффективного производства РНК требует многофакторной оптимизации с одновременным контролем сложного профиля примесей.
В ЮРіЯ-ФАРМ мы провели масштабные исследования характеристик этого процесса, чтобы определить пространство оптимизации наиболее критических этапов:
- линеаризация плазмиды;
- транскрипция in vitro;
- мультимодальная хроматографическая очистка;
- хроматографическая очистка на основе гидрофобного взаимодействия;
- ультрафильтрация;
- лиофилизация лекарственного вещества.
Эти характеристики, вместе с применением производственной платформы, позволяют предсказуемо изменять и контролировать критические параметры дизайна процесса, оптимизированного под требования продукта и проекта.
Мы регулярно производим и очищаем продукцию доклинического класса в миллиграммовом масштабе для проведения исследований на животных in vitro и in vivo.
Formulation technologies
Наше стратегическое партнерство с Precision NanoSystems Inc (Канада) позволяет ЮРіЯ-ФАРМ выполнять разработку формуляций наноносителей, включая формуляции на основе LNP/LPX/липосом для РНК и ДНК API, используя масштабированную и проверенную GMP технологию тороидального смесителя NXGEN®. Кроме того, наши ученые-разработчики имеют опыт создания формуляций полимерных наночастиц для доставки нуклеиновых кислот и низкомолекулярных соединений.
Наши производственные возможности варьируют от сотен микролитров до многомилитровых формуляций. Это позволяет обеспечить разработку и доклинические исследования формуляций наноносителей для терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот, а также широкого спектра белков, низкомолекулярных API и комбинаций этих соединений.
Наши собственные возможности органического синтеза и стратегическое сотрудничество с партнерами позволяют внедрять новые варианты химической структуры липидов/липидоидов/полимеров, чтобы нацеливать наноносители и контролировать кинетику высвобождения их содержимого.
Полученные формуляции очищают далее с помощью нескольких методов, включая: диализ/фильтрацию тангенциальным потоком (TFF) для замены буфера, удаление примесей с помощью гель-фильтрационной мультимодальной хроматографии, удаление растворителя и концентрирование с помощью TFF и, наконец, стерильную фильтрацию.
Наша платформа сопровождается рядом аналитических инструментов, позволяющих характеристику, контроль качества и разработку производственного процесса для наноносителей.
Аналитическая платформа
Чтобы обеспечить открытие и разработку производственного процесса для лекарств на основе мРНК, мы внедрили группу специально разработанных и предварительно квалифицированных аналитических методов. Они позволяют осуществлять углубленную характеристику и контроль качества лекарственных субстанций на основе мРНК и формуляций LPX/LNP, чтобы обеспечить надежное картирование связей между структурой и активностью (SAR) вещества и строгий контроль над спецификацией материала для применения в исследованиях или в клинике.
Все методы в аналитической панели были разработаны в соответствии с методологией quality-by-design и выполняются учеными-аналитиками научно-исследовательского центра ЮРіЯ-ФАРМ, что обеспечивает быструю аналитическую обратную связь и устраняет неопределенность, связанную с передачей образца и долгосрочным хранением.
Наша аналитическая панель настроена на характеристики как лекарственных веществ на основе мРНК, так и лекарственных средств, изготовленных на основе LNP/LPX/липосом:
- CE-DAD, CE-LIF (идентификация, состав, распределение длин polyA-хвоста);
- (U)HPLC-UV (идентификация, состав, читота);
- (U)HPLC-MS (эффективность кепирования, распределение длин polyA-хвоста);
- Sanger sequencing (идентификация, сиквенирование полиА-хвоста);
- RT-qPCR, qPCR (идентификация, остаточная pDNA, остаточная E. coli DNA);
- Флуорисцентная спектрометрия (остаточная pDNA, эффективность энкапсуляции, pKa наноносителя);
- люминометрия (эффективность);
- ELISA (potency, остаточные белки E. coli);
- BLI (potency, остаточные белки E. coli);
- DLS (размер частиц, PDI, дзета-потенциал);
- SEC-TDA (идентификация, чистота, размер частиц);
- (U)HPLC-ELSD (определение липидов, липидный состав);
- Bioassays (детеспособность, экспрессия репортера, потенциал к слиянию (DOPE liposomes test).
Также обеспечены все необходимые стандартные процедуры для стерильных инъекционных препаратов.
Кроме того, научно-исследовательский центр ЮРіЯ-ФАРМ обладает дополнительными аналитическими возможностями (Nothern Blotting, NGS, проточная цитометрия, олигонуклеотидное картирование (LC-MS/MS) и т.п.), а также полным набором аналитических инструментов для анализа белков для поддержки открытий и разработки терапевтических средств на основе мРНК.