PЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ДЕЯКИХ МЕХАНІЗМІВ ПРОТИВІРУСНОЇ ДІЇ ДЕКАМЕТОКСИНУ ТА ЕТОНІЮ

Резюме. В результаті проведеного дослідження встановлений механізм противірусної дії біс-четвертинних солей амо­нію, який полягав у гальмуючому впливі на протеолітичну активність вірусу та вірус-мембранного комплексу. Вплив декаметоксину та етонію на позаклітинний вірус пов ‘язаний з можливим ушкодженням або інгібіцією вірусної протеази. Власти­вості цих препаратів як поверхнево активних речовин перешкоджали взаємодії вірусних поверхневих протеїнів та клітинних рецепторів, що й призводило до інгібування протеолітичної активності вірус-мембранного комплексу. Декаметоксин та етоній впливали на ранні етапи взаємодії вірусу з чутливою клітиною такі, як адсорбція, проникнення та депротеїнізація вірусу грипу. Отримані дані співпадають з результатами, одержаними раніше в дослідженнях іп vitro на культурі тканини ХАО.
Ключові слова: біс-четвертиннісолі амонію, декаметоксин, етоній, протеолітична активність, вірус-мембранні взаємодії.
Вступ
Гемаглютинін вірусу грипу (ГА) є поверхневим глікопротеїдом, який для набуття вірусом інфекційних властивостей повинен пройти етап протеолітичного нарізання. В результаті утворюються дві субодиниці: ГА1, яка забезпечує специфічну адсорбцію вірусу на зовнішній мембрані чутливих клітин, та ГА2, що відпо­відає за проникнення вірусу до клітини. Ці субодиниці після протеолітичного нарізання (процесингу) поєднані між собою тільки дисульфідним містком.
Раніше було доведено, що протеолітичні системи відіграють важливу роль у взаємодії вірусів грипу з ха­зяїном взагалі [Лозицкий, 1977]. Саме трипсиноподібні протеази клітин хазяїна приймають участь у вірусному процесингу, який є невід’ємною частиною набуття віру­сом інфекційності, оскільки відомо, що вірус з “ненарізаним” гемаглютиніном, у вигляді єдиної молекули ГА, є неінфекційним. Таким чином, гальмування протеолі­тичних ферментів клітин хазяїна буде призводити до того, що вірус хоча і буде розмножуватись, його інфекційні властивості будуть низькими. Тому будуть гальмуватися подальші процеси адсорбції, проникнен­ня та “роздягання” (депротеїнізацїї) вірусу, що призве­де до зниження репродукції вірусу в цілому.
Було також показано, що препарати очищеного і концентрованого вірусу грипу проявляють протамін-роз-щеплюючу протеолітичну активність [Федчук, 1980], оскільки вірус грипу має власну трипсиноподібну про­теазу. Крім того, під час взаємодії вірусу грипу з плаз­матичними мембранами чутливих клітин спостерігається активація протеолітичної активності утворюваного вірус-мембранного комплексу [Федчук, 1980]. Тобто, стан системи протеолізу на ранніх етапах репродукції вірусу грипу має вагоме значення.
Етоній і декаметоксин є біс-четвертинними солями амонію, їх застосовують як антибактеріальні засоби з широким спектром дії. Відомо, що солі амонію мають лізосомотропні властивості [МаІІіп еі аі., 1982]. Такі ре­човини, знижуючи рівень рН, гальмують процес депро-теїнізації вірусу в клітині, що призводить до гальмуван­ня процесу репродукції вірусу взагалі. Можна розрахо­вувати також, що властивості цих препаратів як катіон­них поверхнево активних речовин будуть впливати на структуру та взаємодію рецепторів вірусу та клітин ха­зяїна, втручаючись у найбільш ранні етапи взаємодії вірусу з клітиною, що також призведе до гальмування процесу вірусної репродукції.
Тому, з метою визначення деяких механізмів проти­вірусної дії декаметоксину та етонію ми вважали за до­цільне дослідити їх вплив на протеолітичну активність під час вірус-мембранної взаємодії.
Матеріали та методи
Вивчення впливу декаметоксину та етонію на про­теолітичні процеси під час вірус-мембранної взаємодії проводили на модельних експериментах з очищеним і концентрованим вірусом грипу А/РП/8/34 (Н1 N1) та ізо­льованими плазматичними мембранами чутливих клітин хоріон-алантоїсних оболонок (ХАО) курячих ембріонів. Очищення та концентрацію вірусу грипу А/РР./8/34 про­водили, використовуючи методи диференційного і гра­дієнтного центрифугування у градієнті концентрацій сахарози та гель-фільтрації на макропористому силохромі [Отчет о НИР, 1980]. Контроль очищення вірусно­го матеріалу проводили спектрофотометричним мето­дом по співвідношенню оптичної щільності при дов­жині хвилі 260 нм, визначаючи кількість білку у пробі, та 280 нм, визначаючи кількість нуклеїнових кислот. Цей показник повинен бути нижчим за 1,25, що відповідає високому ступеню чистоти вірусного матеріалу.
Ізольовані плазматичні мембрани виділяли з клітин хоріон-алантоісних оболонок 12-14-добових курячих ембріонів методом S. Ргіstasova [1981].
Вірус-мембранний комплекс отримували адсорбцією на протязі години при 0°С очищеного концентрованого препарату вірусу на ізольованих плазматичних мембранах. Препарати додавали до експериментальних зразків та інкубували 30-40 хвилин при 37°С – це час, який потрібен для проникнення вірусу крізь мембрану чутливої клітини. Контролем був препарат з додаван­ням фізіологічного розчину. Протеолітичну активність трипсиноподібних протеаз визначали за розщепленням 1% розчину протамін сульфату натрію під впливом трип­синоподібних протеаз при рН 7,6 до аргініну, кількість якого реєстрували фотоколориметричним методом [Вовчук, 1976]. Протамінрозщеплювальну активність визначали як окремо у препаратах вірусу і мембран, так і у вірус-мембранному комплексі.
Таблиця 1. Вплив декаметоксину на протеолітичну активність вірусу грипу, плазматичних мембран та вірус-мембранного комплексу.
  Рівень протамін-розщеплюваної активності (у мкМоль аргініну / хв.)
Контр.1Дослід1Контр.2Дослід 2Контр.3Дослід3
 Вірус4,7×10-21,2×10-26,3×10-25,3×10-27,3×10-22,5×10-2
 Мембрани2,3×10-20,2×10-26,3×10-25,3×10-23,3×10-23,8×10-2
 Вірус-мембранний комплекс5,0×10-20,8×10-215,6×10-210,0×10-24,1×10-23,3×10-2

 

Таблиця 2. Вплив етонію на протеолітичну активність вірусу грипу, плазматичних мембран клітин ХАО та вірус-мембранного комплексу.
  Рівень протамін-розщеплюваної активності (у мкМоль аргініну / хв.)
Контр.1Дослід1Контр.2Дослід 2Контр.3Дослід3
 Вірус4,7×10-22,3×10-26,3×10-25,3×10-27,3×10-23,5×10-2
 Мембрани2,3×10-24,0×10-26,3×10-21,5×10-23,3×10-22,5×10-2
 Вірус-мембранний комплекс5,0×10-23,1×10-215,6×10-210,0×10-24,1×10-23,1×10-2
Результати. Обговорення
Отримані результати свідчать, що декаметоксин у кінцевій концентрації 25 мкг/мл впливав на протеолі­тичну активність як окремо вірусу грипу й ізольованих плазматичних мембран чутливих клітин ХАО, так і на активність вірус-мембранного комплексу (табл.1).
Однак, інгібування протеолітичної активності мемб­ран декаметоксином не було регулярним, на відміну від його впливу на ензиматичну активність вірусу та вірус-мембранного комплексу. Тобто, декаметоксин впливав на протеолітичні процеси, які відбуваються на найбільш ранніх етапах взаємодії вірусу грипу з чутливою кліти­ною, знижуючи ферментативну активність протеаз, зокрема вірусних, що і можна вважати одним з механіз­мів його протигрипозної дії.
Аналогічним чином досліджували вплив етонію на ранні етапи вірус-клітинної взаємодії. В таблиці2 наве­дено результати експериментів. Отримані результати свідчать, що етоній впливав на протеолітичну актив­ність вірусу, ізольованих плазматичних мембран ХАО ції 125 мкг/мл.
Інгібування протеолітичної активності мембран етонієм не було регулярним, на відміну від його впли­ву на ензиматичну активність вірусу та вірус-мембран­ного комплексу. Таким чином, етоній аналогічно дека­метоксину впливає на протеолітичні процеси, які відбу­ваються на найбільш ранніх етапах взаємодії вірусу грипу з чутливою клітиною, інгібуючи активність протеаз, особ­ливо вірусної, що й можна вважати одним з механізмів його протигрипозної дії.
Дані, щодо регулярного інгібуючого впливу дека­метоксину та етонію на ензиматичну активність вірусу співпадають з результатами, отриманими раніше іn vitro [Гридіна та ін., 2004; Лозицький та ін., 2004; Гридіна, 2004]. Досліджувані препарати проявляли певні проти­вірусні властивості у відношенні вірусів грипу на куль­турі тканини ХАО. Чутливими до декаметоксину та етонію були як віруси грипу людини А (серопідтипи H1N1, і H2N2) та В, так і віруси грипу птахів (серопідтипи Н5N3 і Н7N3). При цьому противірусна дія препаратів не зводилась тільки до втручання у процес репродукції. Декаме­токсин та етоній проявляли певну віруліцидну дію. Отже, можна вважати, що одним з механізмів противірусної дії біс-четвертинних солей амонію є вплив на позаклі­тинний вірус. Вплив препаратів на здатність культури тканин ХАО підтримувати репродукцію досліджуваних штамів вірусу грипу був не завжди регулярним.
Висновки та перспективи подальших розробок
1. Встановлено, що біс-четвертинні солі амонію (де­каметоксин та етоній) спричиняли регулярний вплив на ензиматичну активність вірусу та вірус-мембранного комплексу. Інгібіція протеолітичної активності ними мембран була нерегулярною. Отримані дані співпада­ють з результатами, одержаними раніше в досліджен­нях іп \Аіго на культурі тканини ХАО.
2. Механізм дії цих препаратів пов’язаний із впли­вом на позаклітинний вірус та можливим ушкоджен­ням або гальмуванням вірусної протеази.
3. Властивості цих препаратів як поверхнево актив­них речовин можуть перешкоджати взаємодії вірусних поверхневих протеїнів з клітинними рецепторами, що й призводить до інгібування протеолітичної активності вірус-мембранного комплексу.
4. Декаметоксин та етоній впливають на ранні етапи взаємодії вірусу з клітиною-хазяїна такі, як адсорбція, проникнення та депротеїнізація вірусу грипу.
Заслуговує на увагу подальше вивчення механізмів противірусної дії нових антисептиків для створення ефективних противірусних засобів.